非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑盒（免提法）

試劑盒應用

本試劑盒主要用于動物組織及血液中非洲豬瘟病毒DNA的擴增。將組織液（包括組織研磨液、細胞懸液、血液、血清、精液、唾液、尿液等）、組織塊以及環(huán)境和拭子等樣本進行處理后，可直接用于擴增。本試劑盒中使用的Rapid DNA-Lysis采用du特配方，能夠快速高效的裂解各種常見樣本，無需反復離心，從而獲得高質量的DNA。試劑中引入了dUTP/UDG防污染系統，可消除擴增污染對qPCR的影響。

本試劑盒僅供研究使用，不可用于食品、化妝品等領域。

試劑盒組成

 保存條件

-20oC保存。

使用前將Rapid DNA-Lysis室溫充分混勻；熒光PCR反應液、陽性對照溶解后需置于冰上。

需要準備

熒光定量PCR儀、恒溫金屬浴、離心機、移液器

使用方法

一、不同樣品的處理方法

1. 組織液的處理

（1）組織液包括組織研磨液、細胞懸液、血清、血液、唾液、尿液、精液等。取10 μL組織液置于離心管中。

（2）加入20 μLRapid DNA-Lysis。

（3）混勻。

（4）置于55℃作用5分鐘，加入100μL樣品稀釋液，混勻后，取上清。

2. 組織塊的處理

（1）用眼科剪取半顆米粒大小的組織塊（< 3 mm³），并將組織塊剪成肉泥狀。

（2）加入20 μL Rapid DNA-Lysis。

（3）混勻。

（4）置于55℃作用5分鐘，加入100μL樣品稀釋液，混勻。

（5）8000轉離心30秒取上清。

3. 環(huán)境樣本和拭子的處理

（1）用棉簽反復涂抹桌面、鞋底、頭發(fā)、車輪等表面，并將棉棒浸泡在500ul（生理鹽水、PBS或水）中，作用5分鐘，將棉簽中液體擠壓至EP管中。

（2）吸取10 μL(1)中液體，加入20 μLRapid  DNA-Lysis。

（3）混勻。

（4）置于55℃作用5分鐘。加入100μL樣品稀釋液，混勻取上清。

4.  提取對照的處理

（1）在上述1,2,3樣品處理的同時，取10 μL（生理鹽水、PBS或水）加入20 μL Rapid DNA-Lysis。

（2）混勻。

（3）置于55℃作用5分鐘，加入100μL樣品稀釋液，混勻取上清。

二、在DNase free 的離心管中配制熒光定量PCR反應體系

三、按照以下方法設定熒光定量PCR反應

設置熒光基團為Fam，淬滅基團為BHQ，參比基團為None。退火延伸步驟中采集熒光數據。

四、結果判定

陽性對照：Ct值<35且有明顯擴增曲線，呈典型的S型曲線。

陰性對照：無Ct值，無明顯擴增曲線，結果成立。

待檢樣品：Ct值>40或無，則為陰性。

35<Ct<40，且有S形擴增曲線，則為可疑。若無明顯擴增曲線，則為陰性。可疑樣品需重新處理樣品后再次檢測，若Ct<40且出現S形曲線，則為陽性，反之為陰性。

Ct≤35，且有明顯的S形擴增曲線則為陽性。若擴增曲線呈不規(guī)則形狀需重新檢測。

注意事項

（1） 所有試劑應按照規(guī)定溫度儲存。請勿反復凍融。

（2） 檢測過程應按照分區(qū)（試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)）進行。各區(qū)物品專用，不得交叉使用，避免污染。

（3） 檢測前后均需要對操作區(qū)進行消毒，消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除劑等。耗材（包括吸頭、PCR管）均需要無酶處理或使用商品化的無酶耗材。

（4） 為了避免對檢測結果的影響，應避免使用含有熒光物質的手套，避免用手直接接觸各項試劑，預防交叉污染。

（5） 采集全血時應當使用jv櫞酸鈉抗凝，而不要使用肝素、EDTA。

（6） 樣品處理過程中應當防止交叉污染，推薦按照以下加樣順序加樣，依次為陰性對照、待檢測樣本、陽性對照。

（7） 使用陽性對照時應特別注意防止污染。

（8） PCR反應完成后，用完的PCR管直接丟棄，嚴禁在實驗室開蓋，以防止氣溶膠污染。

（9） 為防止試劑盒污染，請勿將不同批號試劑盒混用。